實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。

　　熒光PCR方法檢測(cè)病原體已成為常規(guī)檢測(cè)技術(shù)，在工作過程中我們也遇到了各種各樣、千奇百怪的問題，那么在PCR儀出現(xiàn)故障的時(shí)候應(yīng)該怎么解決呢？

　　01反應(yīng)后反應(yīng)管壁出現(xiàn)液滴?

　　原因1：運(yùn)行程序前沒有開啟熱蓋加熱功能

　　解決方法：開啟熱蓋加熱功能

　　原因2：反應(yīng)結(jié)束后低溫保存時(shí)間過久

　　解決方法：運(yùn)行結(jié)束后，熱蓋將自動(dòng)關(guān)閉，所以冷凝會(huì)自然出現(xiàn)，這不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，將反應(yīng)管置于離心機(jī)上瞬時(shí)離心機(jī)使液滴回到管子底部即可。

　　02反應(yīng)管氣泡在 PCR 反應(yīng)時(shí)，加熱破裂

　　反應(yīng)時(shí)在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)了氣泡，導(dǎo)致中途產(chǎn)生了較大的波動(dòng)，其特點(diǎn)是單個(gè)樣本的幾個(gè)通道的熒光曲線同時(shí)在某個(gè)循環(huán)出現(xiàn)趨勢(shì)一致的波動(dòng)。

　　分析原因：氣泡在 PCR 反應(yīng)的過程中被加熱，在某個(gè)時(shí)刻破裂，此時(shí)出現(xiàn)熒光擾動(dòng)，在這個(gè)循環(huán)檢測(cè)到的熒光型號(hào)和上一個(gè)循環(huán)不一樣，此時(shí)如果波動(dòng)位于基線期很可能就被軟件識(shí)別為開始擴(kuò)增的拐點(diǎn)，擴(kuò)增曲線就會(huì)產(chǎn)生結(jié)果。

　　03使用微孔板，

　　反應(yīng)后反應(yīng)液有明顯蒸發(fā)？

　　方法1：確保使用高質(zhì)量的微孔板，反應(yīng)前要嚴(yán)格密封；

　　方法2：確保蓋熱蓋，適當(dāng)提高熱蓋的溫度；

　　方法3：增大反應(yīng)體積。

　　04使用PCR管，

　　反應(yīng)后PCR的管內(nèi)反應(yīng)液有明顯蒸發(fā)？

　　方法1：確保使用高質(zhì)量的PCR管；

　　方法2：在樣品臺(tái)的四角放置四個(gè)同樣的空PCR管，以保證熱蓋壓在哥PCR管上的壓力均勻。

　　05PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，

　　樣品可以一直放在PCR儀中低溫保存嘛？

　　當(dāng)程序運(yùn)行結(jié)束后，及時(shí)取出樣品并停止儀器運(yùn)行，而不要把儀器當(dāng)“冰箱”使用，低溫保存時(shí)溫度盡量設(shè)定得比較高，如8℃，這可以延長儀器的使用壽命。